Lata biocatalytic membolehkan pembuatan Enlicitide peptida makrosiklik

Perencat PCSK9 oral penyiasatan MSD, enlicitide decanoate (MK-0616), ialah perencat PCSK9 peptida makrosiklik oral pertama yang menunjukkan penurunan LDL-C yang ketara pada manusia. Enlicitide telah dibangunkan daripada skrin paparan mRNA peptida monosiklik dan kemudiannya distabilkan melalui pautan silang bukan peptida untuk menghasilkan struktur yang terdiri daripada tiga kitaran makro bercantum. Oktapeptida kompleks ini mengandungi enam asid amino tidak semulajadi dan dua proteinogenik yang disambungkan oleh 12 ikatan amida dan penghubung rantai enam karbon pusat. Sintesis kimia tradisional memerlukan 43 langkah, manipulasi kumpulan perlindungan (hampir separuh daripada langkah sintetik), penulenan kromatografi, dan langkah metatesis penutupan cincin bermangkin ruthenium yang sangat cair, mengehadkan skalabilitas dan kemampanan.

Pembangunan Pembuatan Chemoenzymatic

Para saintis MSD membangunkan proses kemoenzimatik yang ringkas dan konvergen untuk menghasilkan enlicitide decanoate (1) yang didayakan oleh gandingan langsung monomer oleh ligase asid amino, digabungkan dengan pengikatan serpihan peptida biokatalitik dan makrocyclizations menggunakan esterase dan reduktase imina.

Pencapaian Utama

Pemasangan lata tiga enzim menggunakan ligase genggam ATP

- Lata tiga enzim (dua ligase genggam ATP yang direka bentuk + kitar semula ATP) memasang tetrapeptida daripada asid amino yang tidak dilindungi. Ligase genggam ATP (khususnya ligase asid amino yang bergantung kepada ATP, AAL) ialah enzim yang memangkinkan pembentukan ikatan amida antara asid amino atau peptida yang tidak dilindungi menggunakan ATP sebagai sumber tenaga. Mekanisme mereka diteruskan melalui perantaraan anhidrida campuran, yang membolehkan gandingan langsung tanpa memerlukan kumpulan perlindungan pada amina nukleofilik atau penderma asil teraktif. Dalam kajian ini, penyelidik menggunakan ligase ATP-grasp daripada Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) dan varian kejuruteraan (Trp-BaAALEng dan Phe-BaAALEng) untuk secara selektif memanjangkan dipeptida dengan dua asid amino bukan semulajadi (analog triptofan dan fenilalanin) dalam lata satu periuk. Ligase ini mempunyai poket elektrofil yang sempit dan terkubur yang menerima asid amino tunggal sebagai elektrofil (substrat terminal-C) tetapi boleh menampung peptida yang lebih panjang sebagai N-nukleofil. Selektif ini menjadikannya sesuai untuk pemasangan peptida bebas kumpulan yang berjujukan dan melindungi daripada terminal-C ke terminal-N. ATP yang digunakan dikitar semula menggunakan kinase polifosfat (FbPPKWT) dengan heksametafosfat yang murah sebagai penderma fosfat.

Esterase kejuruteraan (RsEstEng) makrolaktamisasi regioselective

- Esterase kejuruteraan (RsEstEng) memangkinkan makrolaktamisasi regioselective untuk membentuk serpihan Utara (hasil 73%, skala 52 kg). RsEstEng berasal daripada carboxylesterase jenis liar (RsEst) yang dikenal pasti daripada Roseibacillus sp. Fungsi asalnya ialah hidrolisis ikatan ester. Melalui evolusi terarah, para penyelidik menukarnya menjadi pemangkin untuk makrolaktamisasi regioselective - pembentukan ikatan amida makrosiklik - dalam sintesis serpihan Utara (4) enlicitide. Ia menerima ester tert-butil yang stabil dan besar bagi tetrapeptida linear (9) sebagai penderma asil untuk menghasilkan peptida makrosiklik (4) untuk membentuk ikatan amida intramolekul. Ia mencapai kitaran terpilih tanpa oligomer yang boleh dikesan dan hanya 0.8% hasil sampingan hidrolisis ester, walaupun di bawah keadaan kekuatan ionik yang tinggi daripada lata enzimatik sebelumnya.

Pengikatan antara molekul tioesterase kejuruteraan (BlTEEng).

- Tioesterase Kejuruteraan (BlTEEng) melakukan pengikatan antara molekul serpihan Utara (4) dan Timur (3) tanpa epimerisasi. BlTEEng ialah versi diubah suai bagi domain thioesterase (TE) yang asalnya dikeluarkan daripada sintetase peptida bukan ribosom (NRPS) Brevibacillus laterosporus (BlTE). Thioesterase jenis liar dalam sistem NRPS biasanya memangkinkan makrocyclization atau pembebasan peptida linear daripada protein pembawa melalui ikatan thioester. Varian kejuruteraan BlTE menunjukkan beberapa aktiviti tetapi menyukai produk sampingan dimerik. Kejuruteraan enzim mengalihkan enzim untuk memangkinkan pengikatan antara molekul menggunakan oksoester isopropil yang lebih stabil dan bukannya tioester labil hidrolitik semula jadi.

Makrosiklisasi aminasi reduktif lata empat enzim

- Lata empat enzim (PsIREDEng, KsKREDEng, dan enzim kitar semula kofaktor StLDHWT, TvADHWT) mencapai makrocyclization aminasi reduktif untuk membentuk diamina basikal (hasil 69%, skala 46 kg). KsKREDEng ialah ketoreduktase kejuruteraan daripada Kyrpidia sp. Ia memangkinkan pengoksidaan sebatian alkohol benzilik (10) kepada aldehid sementara (11) bergantung kepada NAD+. PsIRED ialah reduktase imina daripada Pseudogymnoascus sp. Ia bergantung kepada NADPH. PsIREDEng memangkinkan aminasi reduktif aldehid (11) dan amina sedia ada untuk membentuk imina kitaran (12), diikuti dengan pengurangan kepada kitaran makro amina sekunder (13). StLDHWT menjana semula NAD+ untuk langkah oksidatif dengan mengurangkan piruvat kepada laktat, manakala TvADHWT menjana semula NADPH untuk langkah reduktif dengan mengoksidakan isopropanol kepada aseton.

Makrocyclization akhir melalui kejuruteraan PBP thioesterase

- Gandingan kimia dengan serpihan Barat (2), diikuti oleh kejuruteraan penicillin-binding protein thioesterase (SsPBP-TEEng), menutup kitaran makro akhir pada kepekatan tinggi (70 g/L) – mengatasi had pencairan biasa (5 g/L dalam sintesis tradisional). Proses keseluruhan merangkumi tiga langkah lata, 7 enzim tambahan yang direkayasa + 3, hasil keseluruhan 39%, demonstrasi berskala berbilang kilogram, >99% ketulenan, tiada kromatografi dan tiada kumpulan pelindung. Kerja ini menyediakan pelan tindakan yang mampan dan berskala untuk mengeluarkan peptida makrosiklik kompleks, secara mendadak mengurangkan kiraan langkah dan pembaziran sambil meningkatkan kecekapan dan akses pesakit.